[ Pobierz całość w formacie PDF ]
.Otrzymany ekstrakt jest jednaksilnie zanieczyszczony i nie może być w takiej postaci analizowany.Oczyszczenie ekstraktupolega na rozdzieleniu i usunięciu związków przeszkadzających w oznaczaniuPCDDs/PCDFs, występujących niejednokrotnie na poziomie stężeń 106 razy wyższym niżanalit.Operacje te mogą spowodować spore straty analitu.W celu obliczenia poziomuodzysku dioksyn w przeprowadzonych przez autora badaniach wprowadzano do próbkiwzorce wewnętrzne, wzorce odzysku oraz tzw.wzorzec strzykawkowy, które są analogamikongenerów PCDDs i PCDFs znaczonymi stabilnymi izotopami węgla 13C.Są to substancjejednoskładnikowe lub mieszaniny o ściśle określonym składzie i stężeniu przygotowane wodpowiednich rozpuszczalnikach.Dla próbek wodnych wzorce przygotowywano w acetonielub metanolu, a do oznaczania próbek stałych, olejów i tkanek - w rozpuszczalnikach13 13hydrofobowych.Gotowe do użycia roztwory wzorcowe C-PCDDs i C-PCDFsprodukowane są przez wyspecjalizowane firmy chemiczne.Podczas czynności związanych zprzygotowaniem próbek do analiz wprowadzano niekiedy dodatkowo substancje wzorcowedioksyn znaczone izotopem chloru 37Cl.Stosowane techniki separacji PCDDs/PCDFs muszą zapewnić wysoką selektywnośćrozdzielania.W literaturze opisano wiele różnych procedur, w zależności od natury samejpróbki, składu matrycy oraz stężenia PCDDs i PCDFs [1,13,22,33-36].24Poniżej przedstawiono opracowane przez autora analityczne procedury przygotowania próbekdo analiz i oznaczania dioksyn w próbkach biologicznych, środowiskowych i przemysłowych.Procedury te zostały wielokrotnie sprawdzone w praktyce, m.in.w międzynarodowychporównaniach międzylaboratoryjnych.Jakkolwiek procedury te oparte są w dużej części nametodyce szeroko opisanej w literaturze naukowej [1,7-9,13,19,33-36] dla analizwykorzystujących systemy wysokorozdzielczych spektrometrów mas, gdzie oczyszczeniepróbek nie jest aż tak ważne  zostały one znacznie zaadaptowane do analiz prowadzonychprzy użyciu spektrometrów mas z detektorem kwadrupolowym oraz z podwójną fragmentacjącząsteczki (spektrometria MS/MS) przy zastosowaniu pułapki jonowej.Oznaczanie PCDDs i PCDFs w żywności i materiale biologicznym napotyka spore trudnościspowodowane:a) ich bardzo niską zawartością w badanych próbkach,b) niezwykle bogatą matrycą tych próbek, zawierającą znaczne w stosunku do dioksynstężenie innych chlorowanych związków aromatycznych, takich jak etery difenylowe,fenoksyfenole, a w szczególności polichlorowane bifenyle.Substancje te występują wpróbkach biologicznych w stężeniach niekiedy 1000-krotnie wyższych niż PCDDs iPCDFs [8,9,23,34-39].Oznaczanie wymaga przede wszystkim wysokiej specyficzności metody przygotowaniapróbek do analizy.Z tego też względu do oznaczeń dioksyn w materiale biologicznym i żywności nie nadają sięsystemy GC-MS o niskiej rozdzielczości, a więc typowe w innych zastosowaniachspektrometry kwadrupolowe lub pułapki jonowe.Do analiz należy stosować spektrometrymagnetyczne o wysokiej rozdzielczości.W przedstawionych w niniejszej pracy badaniach zzastosowaniem systemów z podwójną fragmentacją GC-MS/MS uzyskano dobre rezultaty woznaczaniu PCDDs i PCDFs w mleku, mięsie, tkance zwierzęcej i ludzkiej.Poziomwykrywalności stosowanej metody obliczono na 0,5 pg dla 2,3,7,8-TCDD oraz dla 1,2,3,7,8-P5CDD w odniesieniu do 1 g tłuszczu.Dla OCDD i OCDF poziom ten wynosi odpowiednio2 do 5pg/g tłuszczu.Możliwości stosowanego systemu GC-MS/MS są więc porównywalne zo wiele bardziej kosztownymi systemami chromatografów gazowych sprzężonych zmagnetycznymi spektrometrami mas o wysokiej rozdzielczości.8.a.Metody bioanalityczneW badaniach toksykologicznych i biochemicznych wykorzystywane są uwarunkowaniaprowadzące do otrzymania specyficznych zachowań systemów biologicznych związane z ichuczuleniem na związki chemiczne z grupy chlorowanych węglowodorów aromatycznych wtym głównie PCBs, PCDDs i PCDFs.W metodach analizy chemicznej otrzymuje sięinformację o bezwzględnej zawartości badanych związków chemicznych w próbce.Jakkolwiek wynik takiej analizy umożliwia stworzenie pełnego obrazu badanej próbki podwzględem budowy chemicznej zanieczyszczeń związkami chloroorganicznymi to nie pozwalana otrzymanie bezpośredniej informacji o rzeczywistej toksyczności badanej próbki.Zewzględu na synergiczne jak i antagonistyczne oddziaływanie poszczególnych kongenerówdioksyn w zakresie ich toksycznego działania na organizmy żywe nie ma możliwościbezpośredniego określenia potencjalnej toksyczności badanej próbki w oparciu o nawetbardzo dokładne wyniki chemicznej analizy kongenerowej.Tym bardziej, że współczynnikiTEF stosowane do obliczenia poziomu toksyczności TEQ przyjęte zostały na podstawiepewnych przybliżeń w toksycznym oddziaływaniu poszczególnych kongenerów PCDDs,PCDFs i PCBs na organizmy żywe.W badaniach toksykologicznych przyjęto uproszczeniepolegające na założeniu podobnego działania toksycznego dla kongenerów w obrębie tej25samej grupy PCDDs/PCDFs jak np.Heksachlorodibenzodioksyny, które tworzą trzy 2,3,7,8-chloeropdstawione kongenery.Dla uproszczenia przyjęto dla wszystkich współczynnikitoksyczności TEF=0,1.Podobnie jak dla czterech kongenerów heksachlorodibenzofuranów.Jedynie dla kongenerów TCDD/F oraz P5CDD/F współczynniki toksyczności odnoszą się doporównania rzeczywistego oddziaływania toksycznego każdego kongeneru z osobna.StądTEQ należy traktować jako pewien wskaz
nik poziomu toksyczności w ocenie stopniaskażenia środowiska czy poziomu zagrożenia dla zdrowia, natomiast nie można na jegopodstawie przewidywać rzeczywistego oddziaływania toksycznego na organizmy żywe.Metody bioanalityczne można podzielić na:1.Analizy biologiczne (bioassay)2.Analizy w oparciu o zdolność wiązania ligandu (ligand binding assay)3.Analizy immunologiczne i radioimmunologiczne (immunoassay, radioimmunoassay IAs,RIAs)Ad.1.: W metodzie analizy biologicznej bada się stężenie produktów działania enzymówhydroksylujących, szczególnie cytochromu P450(CYP) 1A1 i innych enzymów sprzęgających(np.sulfonujących) wytwarzanych z genów w jądrze komórkowym pod wpływemindukujących właściwości receptorów związków aromatycznych (Ah receptory) do którychuprzednio nastąpiło przyłączenie cząsteczki dioksyny.Po przyłączeniu dioksyny do Ahreceptora następuje jego przeniknięcie przez błonę komórkową a następnie do jądrakomórkowego gdzie wskutek oddziaływania z DNA następuje indukcja specyficznych genówtworzących również specyficzne enzymy [1].Ad.2: Metody analizy wiązania ligandu polegają na wykorzystaniu właściwościkonkurencyjnego przyłączania cząsteczki dioksyny jako ligandu do wewnątrzkomórkowegobiałka receptorowego (tzw.receptor Ah) z wprowadzonymi cząsteczkami dioksynznaczonych radioizotopem 3H, 14C lub 125I.Frakcję wolną zawierającą cząsteczki znaczonejdioksyny oddziela się od związanej z białkiem receptora a następnie prowadzi się pomiarradioaktywności z zastosowania licznika scyntylacyjnego [ Pobierz całość w formacie PDF ]